试剂盒组成

保存方法及注意事项

本试剂盒在室温 (15-25°C) 干燥保存，有效期见包装。

Binding Buffer 中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套， 避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理 盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

产品介绍

本试剂盒适用于从 TAE 和 TBE 琼脂糖凝胶中回收 100 bp- 10 kb 的 DNA 片段，回 收效率可达 80%。试剂盒采用特殊的吸附膜，能够有选择性地吸附核酸分子，去除其他 杂质，得到高质量的 DNA 回收产物。本试剂盒采用的膜结合液中不含有干扰酶活性的 碘化钠，所得到的 DNA 可直接用于酶切、连接、测序等后续的分子生物学试验。本试 剂盒具有以下特点 :

1. 适用范围广，回收效率高，对于 100 bp-10 kb 之间的 DNA 片段回收效率在 80% 以上。

2. 操作简单快速，整个回收过程仅需 15 分钟。

3. 洗脱效率高， 洗脱体积最小可低至 15 μl。

快速操作流程

1. 准备工作

a. 检查 Wash Solution 中是否已经加入乙醇。

b. 检查 Binding Buffer 是否出现沉淀。

c. 将水浴锅调至 65℃。

2. 从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重。

3. 加入胶块重量 3-6 倍的 Binding Buffer，65℃ 水浴 5-10 min 溶胶。

4. ( 选 做 ) 对 于 < 500 bp 的 片 段， 加 入 1/3 Binding Buffer 体积的异丙醇。

5. 将溶胶液移入吸附柱中，8,000 × g 离心 30 sec。倒 掉收集管中液体。

6. 加入 500 μl Wash Solution，9,000 × g 离心 30 sec， 倒掉收集管中液体。

7. 重复步骤 6 一次。

8. 空吸附柱于 9,000×g 离心 1 min。

9. 将吸附柱放入一个干净的 1.5 ml 离心管中，在吸附 膜中央加入 15-40 μl Elution Buffer，室温静置 1 min 钟后，离心 1 min。保存管中 DNA 溶液。

标准纯化步骤

自备材料：小型高速离心机（最大离心率 ≥12,000×g）、1.5 ml 离心管、无水乙醇、 异丙醇（非必须）等。

按瓶身标签说明在Wash Solution中加入相应量的无水乙醇，混匀后在瓶身做好标记， 于室温密闭保存。

Binding Buffer 在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于 37℃ 溶解 沉淀。冷却至室温后使用。

提前将水浴锅调制 65℃ 备用。

1、 通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的 DNA 片段与其它片段分开，用干净的手术刀片 将含目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶块切下，放入 1.5 ml 离心管中，称重。

 尽可能多地去掉不含目标 DNA 的琼脂糖。

 每管琼脂糖凝胶块不要超过 400 mg，否则导致溶胶不完全。

 切胶过程尽可能快，减少 DNA 在紫外线中的暴露时间以降低对 DNA 的损伤。

2、 根据胶块的重量和浓度，按每 100 mg 琼脂糖（如胶块不足 100 mg，则用水补充至 100 mg）加 300-600 μl 的比例加入 Binding Buffer。

 凝胶浓度 ≤1%，每 100 mg 凝胶加入 300 μl Binding Buffer；

 凝胶浓度＞ 1%，≤1.5%，每 100 mg 凝胶加入 400 μl Binding Buffer；

 凝胶浓度＞ 1.5%，≤2%，每 100 mg 凝胶加入 500 μl Binding Buffer；

 凝胶浓度＞ 2%，每 100 mg 凝胶加入 600 μl Binding Buffer。

3、 将离心管置于65℃水浴5-10 min，直至胶块完全溶化，水浴期间多次混匀以加速溶胶。

 胶块完全溶化即可，过长时间的处理可能导致 DNA 损伤。

4、 （可选步骤）当目的片段＜500 bp时，加入所使用的Binding Buffer体积 1/3的异丙醇， 混匀。当目的片段 ≥500 bp 时，此步骤可以省略，直接进行步骤5。

5、 将溶化好的溶液全部吸入吸附柱，8000×g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸 附柱放入同一个收集管中。

 如果溶液总体积大于 750 μl，则每次使用 750 μl，多次上柱。

 如果回收的 DNA 片段较大或浓度较低时，可将收集管中的液体再一次加入同一 吸附柱中离心。此步骤可以进一步提高 DNA 的回收效率。

6、 向吸附柱中加入 500 μl Wash Solution，9000×g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体， 将吸附柱放入同一个收集管中。

 Wash Solution 首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。

 建议沿管壁缓慢加入 Wash Solution，以便更彻底地洗去盐离子。

7、 重复步骤 6. 一次。

8、 将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g 离心 1 min。

 此步骤就不可以省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验

9、 将吸附柱放入一个干净的 1.5 ml 离心管中，在吸附膜中央加入 15-40 μl Elution Buffer，室温静置 1-2 min，9000×g 离心 1 min。将所得到的 DNA 溶液置于 -20℃ 保存 或用于后续实验。

 Elution Buffer 为 2.5 mM Tris-HCL pH8.5，可以用 TE 或水（pH ＞ 7.0）代替。

 将 Elution Buffer 预热至 60℃ 可以进一步提高得率。

 请勿使用小于 15 μl 的洗脱液进行洗脱。

常见问题解答

1、DNA 回收效率较低或者未回收到目的片段

A、胶块溶解不完全，可适当延长水浴的时间并增加颠倒混匀的频率辅助溶解。

B、胶块体积太大，溶胶困难，可先将胶块切碎，溶胶后分多次上柱离心，回收 DNA 片段。

C、漂洗液中未加入正确量的无水乙醇。

D、Agarose 抑制 DNA 与吸附材料的结合。应尽量切除不含目的 DNA 片段的 Agarose 胶。

E、提高 Binding Buffer 的相对浓度，增加 DNA 与吸附膜的作用时间（静置时间）在 一定程度上可以提高回收率。

F、如果纯化的片段长度大于 4 kb 或者目的片段含量较少，可以将洗脱液再次加入至 吸附柱中进行洗脱以提高回收效率。

G、洗脱液加入位置不正确，洗脱液应加在硅胶膜的中心部位，以完全覆盖硅胶膜的 表面，达到最大的洗脱效率。

H、洗脱液不合适，洗脱缓冲液的 pH 值对洗脱效率有影响，如果使用水进行洗脱， 请确保其 pH 值＞ 7.0，pH 值过低可能导致低洗脱效率。

I、洗脱时间过短，洗脱时放置 5 min 可达到较好的洗脱效果，洗脱时将洗脱液预热 至 60℃ 后使用，有利于提高洗脱效率。

2、回收 DNA 进行后续酶切反应效率低

A、洗脱产物中含有残留的乙醇，可将空柱离心后的吸附柱开盖室温干燥 2-5 min， 有助于残留的酒精挥发完全。

B、盐分的残留，请确保使用 Wash Solution 洗涤两次，每次 500 μl 沿管壁加入，有 助于彻底去除管壁上的盐分。 

C、琼脂糖质量差，请选用高质量的琼脂糖。

3、琼脂糖凝胶胶块不溶

A、琼脂糖质量差，请选用高质的琼脂糖。

B、含目的片段的胶块在空气中放置时间过长，使胶块失水、干燥。建议切胶后立即 进行胶回收，或将胶块保存在 4℃ 或 -20℃ 备用。

C、配置琼脂糖凝胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧，应重新配置缓冲液。

4、洗脱液的选择

A、洗脱液可以根据后续实验的需要来确定，一般情况下，若需要进行测序反应，请 用双蒸水洗脱，如果需要长期保存 DNA，请用 TE 洗脱。

Note
For research use only. Not suitable for clinical or therapeutic use.