1、产品简介

 Ezmax®“一步法快速克隆试剂盒”可用于无缝克隆外源 DNA 片段：简单、快速、 高效。该方法不依赖于任何限制性内切酶，可将任何外源 DNA 片段定向克隆至任意载体的任意位 点（特殊情况，如有毒基因的克隆或插入外源 DNA 后导致质粒本身不稳定等除外）。因此，在基因克隆、DNA 拼接和 DNA 定点突变等领域有广泛用途。

2、产品组成

注：阳性对照载体为 Amp 抗性。

3、产品保存

本产品应置于-20 °C 储存，并在使用时注意保持低温（如置于冰上）。

4、使用说明

4.1 制备线性化载体

在靶标载体上选择合适的克隆位点，对克隆载体进行线性化处理。如果可以选择的话，建议尽量 选择无重复序列、无高级结构且 GC 含量在 40%~65%之间的区域用于外源 DNA 的克隆。常用的载 体线性化方法包括：限制性内切酶酶切和设计反向引物进行 PCR 扩增制备。

4.2 酶切法制备线性化克隆载体

如果有合适的酶切位点，建议使用该方法，整个操作流程也比较简单。其中，双酶切比单酶切更 好。酶切后，可以取少量酶切产物进行电泳，以确保全部载体被切开。对于绝大部分酶，可以对 酶切产物进行 65° C 高温 20 min 灭活，然后直接用于后续无缝拼接反应，而无需对酶切的载体进行 胶回收或过柱回收等处理。

4.3 设计反向引物进行 PCR 扩增制备

建议使用高保真 DNA 聚合酶进行载体的扩增（如 FastPfu 酶等）以降低 PCR 扩 增过程中引入的突变率。本试剂盒与常规 PCR 的反应体系兼容；因此，如果 PCR 产物条带单一， 则可直接用于后续的重组反应（注：线性化载体作为模板时无需去除；而环形载体需要去除。如 载体有甲基化，则可使用 DpnI 进行酶切去除）。反之，如果 PCR 扩增产物的纯度较低，则应将 PCR 产物进行电泳后用胶回收进行纯化。

4.4 设计用于扩增外源 DNA 片段的引物

通过在引物的 5’端引入与线性化克隆载体末端一致的 DNA 序列，长度在 15-20 bp 之间。以克隆外 源 DNA 到公司的 pUC18H 质粒的 HincII 位点为例，扩增引物的设计如下图 1 所示：

图 1. 使用一步法克隆试剂盒时引物设计原理。

注意外源 DNA的正/反向引物（gene-f/ gene-r）携带 20 bp 序列，与载体的末端序列同源（反向 互补）。pUC18H 为公司在通用质粒 pUC18 的基础上改造获得的，可以用于目的基因的克 隆。pUC18H 被去除了绝大部分常用的酶切位点，且可用蓝白斑进行筛选。

建议使用高保真 DNA 聚合酶（如 FastPfu 酶等）进行外源 DNA 片段的扩增； 无需考虑产物末端是否有 A加尾，不影响最终的拼接（即使加了 A，也会在后续的拼接反应中被切 除）。与载体制备的流程类似，如果外源 DNA 的 PCR 扩增条带比较特异，则可以不用纯化，直接 用于后续的拼接反应（注：如果用于制备外源 DNA 的模板为环形质粒，且抗性和后续拼接的载体 相同，则残留的外源模板会造成转化背景，因而需要去除。可以通过胶回收或者 DpnI 酶切去除含 有甲基化修饰的模板）。

4.5 进行重组反应

4.6 反应产物转化

上述反应液可以直接用于感受态转化（一般为大肠杆菌感受态；推荐使用高效率感受态细胞）。热激法转化流程：将反应液加到 100-200 μL感受态细胞中，混匀后于冰上放 置 30 min；42 °C 热激 90 秒，冰水浴孵育 2 min；加入 800 μL SOC 或 LB 培养基，于 37 °C 摇床孵 育 45 min。取适量（10-100 μL）菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置于 37 °C 培 养箱过夜培养。 平板上长出的克隆可以使用“菌落 PCR 的方法”进行快速鉴定（或者“质粒快速抽提 的方法”）。针对阳性克隆，可根据实验需求 进行进一步的序列测定。

注：

a.除了大肠杆菌感受态细胞外，反应产物理论上也可以直接转化其它物种的化学感受态细胞。

b.由于反应体系中含有盐离子，反应产物不可以直接用于电击转化;若需要电击转化，则需要对反应产物进行脱盐处理。由于用于反应的DNA很少，不推荐使用乙醇沉淀或者胶回收纯化，可使用适合微量DNA透析的滤膜进行脱盐处理。

5、阳性对照

图 2. 使用试剂盒的阳性对照进行无缝拼接的实验结果。最左边泳道为 1-kb DNA ladder。

使用阳性对照，载体（4 kb）和 1 个外源 DNA 片段（2.2 kb）进行无缝拼接，长出的克隆利用菌落 PCR 的方法进行验证，正确的目的条带大小应该为 2.2 kb 左右。从图 2 中可以看出，随机挑选的 20 个克隆全部正确（100%阳性率）。随后对上述阳性克隆进行两端 DNA 测序；测序结果表明，阳性 克隆的序列全部正确。

6、常见问题

Note
For research use only. Not suitable for clinical or therapeutic use.