1、产品简介

Ezmax® “一步法快速克隆试剂盒”可用于无缝克隆外源 DNA 片段：简单、快速、 高效。该方法不依赖于任何限制性内切酶，可将任何外源 DNA 片段定向克隆至任意载体的任意位 点（特殊情况，如有毒基因的克隆或插入外源 DNA 后导致质粒本身不稳定等除外）。因此，在基 因克隆、DNA 拼接和 DNA 定点突变等领域有广泛用途。

2、产品组成

注：阳性对照载体为 Amp 抗性。

3、产品保存

本产品应置于-20 °C 储存，并在使用时注意保持低温（如置于冰上）。

4、使用说明

4.1 制备线性化载体

在靶标载体上选择合适的克隆位点，对克隆载体进行线性化处理。如果可以选择的话，建议尽量 选择无重复序列、无高级结构且 GC 含量在 40%~65%之间的区域用于外源 DNA 的克隆。常用的载 体线性化方法包括：限制性内切酶酶切和设计反向引物进行 PCR 扩增制备。

4.2 酶切法制备线性化克隆载体

如果有合适的酶切位点，建议使用该方法，整个操作流程也比较简单。其中，双酶切比单酶切更 好。酶切后，可以取少量酶切产物进行电泳，以确保全部载体被切开。对于绝大部分酶，可以对 酶切产物进行 65 °C 高温 20 min 灭活，然后直接用于后续无缝拼接反应，而无需对酶切的载体进行 胶回收或过柱回收等处理。

4.3 设计反向引物进行 PCR 扩增制备

建议使用高保真 DNA 聚合酶进行载体的扩增（如FastPfu 酶等）以降低 PCR 扩 增过程中引入的突变率。本试剂盒与常规 PCR 的反应体系兼容；因此，如果 PCR 产物条带单一， 则可直接用于后续的重组反应（注：线性化载体作为模板时无需去除；而环形载体需要去除。如 载体有甲基化，则可使用 DpnI 进行酶切去除）。反之，如果 PCR 扩增产物的纯度较低，则应将 PCR 产物进行电泳后用胶回收进行纯化。

4.4 设计用于扩增外源 DNA 片段的引物

通过在引物的 5’端引入与线性化克隆载体末端一致的 DNA 序列，长度在 15-20 bp 之间。以克隆外源 DNA 到公司的 pUC18H 质粒的 HincII 位点为例，扩增引物的设计如下图 1 所示：

图 1. 使用一步法克隆试剂盒时引物设计原理。

注意，外源 DNA 携带的 20bp 正/反向引物（gene-f1/ gene-r3），与载体的末端序列同源（反向互 补），且 gene-r1 与 gene-f2、gene-r2 与 gene-f3 均含有反向互补的同源序列，其设计原理与图示中 所示引物序列的设计原理相同。pUC18H为公司在通用质粒 pUC18的基础上改造获得的，可 以用于目的基因的克隆。pUC18H 被去除了绝大部分常用的酶切位点，且可用蓝白斑进行筛选。

建议使用高保真 DNA 聚合酶进行外源 DNA 片段的扩增；无需考虑产物末端是否有 A 加尾，不影 响最终的拼接（即使加了 A，也会在后续的拼接反应中被切除）。与载体制备的流程类似，如果外 源 DNA 的 PCR 扩增条带比较特异，则可以不用纯化，直接用于后续的拼接反应（注：如果用于制备外源 DNA 的模板为环形质粒，且抗性和后续拼接的载体相同，则残留的外源模板会造成转化背 景，因而需要去除。可以通过胶回收或者 DpnI 酶切去除含有甲基化修饰的模板）。

4.5 进行重组反应

4.6 反应产物转化

上述反应液可以直接用于感受态转化（一般为大肠杆菌感受态；推荐使用高效率感受态细胞）。热激法转化流程：将反应液加到 100-200 μL 感受态细胞中，混匀后于冰上 放置 30 min；42 °C 热激 90 秒，冰水浴孵育 2 min；加入 800 μL SOC 或 LB 培养基，于 37 °C 摇床 孵育 45 min。取适量（10-100 μL）菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置于 37 °C 培养箱过夜培养。 平板上长出的克隆可以使用“菌落 PCR 的方法”进行快速鉴定（或者“质粒快速抽 提的方法”）。针对阳性克隆，可根据实验需 求进行进一步的序列测定。

注：

a.除了大肠杆菌感受态细胞外，反应产物理论上也可以直接转化其它物种的化学感受态细胞。

b.由于反应体系中含有盐离子，反应产物不可以直接用于电击转化;若需要电击转化，则需要对反应产物进行脱盐处理。由于用于反应的DNA很少，不推荐使用乙醇沉淀或者胶回收纯化，可使用适合微量DNA透析的滤膜进行脱盐处理。

5、阳性对照

图 2. 使用试剂盒的阳性对照进行无缝拼接的实验结果。最左边泳道为 1-kb DNA ladder。

使用阳性对照载体（4 kb，Amp 抗性）和 4 个外源 DNA 片段（0.5 kb、0.5 kb、0.4 kb、0.8 kb）拼 接后，在克隆位点两边设计引物进行扩增，正确的目的条带大小应该为 2.2 kb 左右。从图 2 可以看 出，随机挑选的 20 个克隆全部为阳性克隆（阳性率 100%）。随后对上述阳性克隆进行两端 DNA 测序，准确率也为 100%。

6、常见问题

Note
For research use only. Not suitable for clinical or therapeutic use.