产品简介

P6 High-Fidelity DNA Polymerase 是基于 Pyrococcus furiosus 的高温 DNA 聚合酶，具有耐热型 5´-3´ 的聚合酶活力以及 3´-5´的核酸外切酶活力，因此属于高保真 DNA 聚合酶（其保真度达到普通 Taq 酶的 55 倍）。该酶经过生物工程改造后，其扩增能力、保真度都得到极大提升，并且具有广泛的模板适应性，扩增速度达到 2-4 kb/min。优化的 2×P6 buffer反应缓冲液对于简单或复杂模板、短片段或长片段 PCR扩增都具有良好的适应性，其中，质粒、λ DNA 等简单模板有效扩增长度可达 40 kb，cDNA 有效扩增长度可达 15 kb，基因组有效扩增长度可达 20 kb。

产品组成

  产品应置于-20 ℃保存。 

产品质控

（1）性能检测 1：在 50 μL PCR 反应体系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase、100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒，扩增 15 kb 的 DNA 目的片段，在 30 个循环扩增后经 1%琼脂糖凝胶检测可在 15 kb 处检测到非常亮且单一的目的条带。

（2）性能检测 2：在 50 μL PCR 反应体系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase、大肠杆菌菌落，扩增 5 kb 的 DNA 目的片段，在 30 个循环扩增后经 1%琼脂糖凝胶检测可在 5 kb 处检测到较亮的单一目的条带。（3）大肠杆菌核酸残留检测：在 20 μL 荧光定量 PCR 反应体系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase 和大肠杆菌特异基因扩增引物（如 gapA）；在不加入大肠杆菌 DNA 模板的情况下，20 个循环内荧光信号值在基线范围。

常规 PCR 反应体系：

1. 在冰浴上设置 PCR 反应（供参考）：

模板:                                     < 500 ng

2× P6 Buffer:                         25 μL

Primer 1/2:                           0.2 - 1.0 μM

dNTPs (10 mM):                   1 μL

P6:                                        1 μL

灭菌蒸馏水 Up to 50 μL

2. PCR 反应参数（供参考）：

(起始变性):                         95 ℃ 5 min

(解链):                                95 ℃ 30 sec

(退火):                                55 ℃ 30 sec

(延伸):                                72 ℃ x min （30-35 循环：2 kb/min）

(最终延伸):                         72 ℃ 7 min

应用实例

P6 扩增速度测试

以pUC18质粒为模板扩增不同长度的DNA片段，PCR反应程序设置为：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。结果如下： 

P6 扩增不同长度的 DNA 片段 

常规 PCR 扩增指南：

1. 简单模板如质粒等可按照 5 sec/kb 设置程序。

2. 大多数模板的预变性温度为 95 度，30 sec-5 min。高 GC 含量模板预变性温度为 98 度，30 sec-5 min。

3. 常规退火时间设置为 10 sec，复杂模板设置为 10 sec-30 sec。

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒为模板扩增不同长度的 DNA 片段，PCR 反应程序设置为： 95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。结果如下：

P6 扩增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA 片段。

长片段扩增指南：

1. 使用高质量的模板。

2. 增加引物长度提高退火温度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加适当浓度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 增加体系中 P6 使用量。 5. 提高变性温度为 98 度，缩短变性时间为 5 sec。

以人基因组为模板扩增不同 GC 含量的 DNA 片段，程序设置为：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。结果如下：

高 GC 和低 GC 模板扩增指南

1. 使用高质量的模板。

2. 高 GC 模板可适当添加 DMSO，一般终浓度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可适当提高退火温度，还可使用 Touch down 的方法进行 PCR 扩增。

4. 低 GC 含量模板可以适当降低退火温度。

Note
For research use only. Not suitable for clinical or therapeutic use.