产品概述

本产品是使用 Probe 探针法进行 qPCR 反应的专用预混液。核心组分 Q3 Taq DNA Polymerase 为一种新型的热启动 DNA 聚合酶，具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点，配合针对 qPCR 优化的最适 buffer，可以有效抑制非特异性扩增，从而显著提高扩增效率，适用于进行高灵敏度的 qPCR 反应。本产品是一种 2×预混试剂，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，靶基因定量准确、重复性好、可信度高。

产品组分

包含：dNTPs, Mg²⁺, Q3 Taq DNA Polymerase 等。 

适用机型

适用机型：本产品使用独特的 ROX Passive Reference Dye，适用于市面上所有类型的荧光定量 PCR 仪（无 ROX 校正机型；低浓度 ROX 校正机型；高浓度 ROX 校正机型)，无需在不同的仪器上调整 ROX 的浓度。包括如下机型：Applied Biosystems 5700，7000， 7300，7700，7900，7900HT，7900HT Fast，StepOne™，StepOnePlus™，7500，7500 Fast，ViiA™7，BioRad CFX96™，CFX384™，iCycler iQ™，iQ™5，MyiQ™， MiniOpticon™，Opticon^®，Opticon 2，Chromo4™，Qiagen/Corbett Rotor-Gene^® Q，RotorGene^® 3000，Rotor-Gene^® 6000，Stratagene MX4000™，MX3005P™，MX3000P™， Eppendorf Mastercycler^® ep realplex，realplex 2s， Roche Applied Science LightCycler™ 480；以及市场上常见的其他荧光定量 PCR 仪。

保存条件

-20 °C 避光保存；Master Mix 解冻后可于 2 ~ 8 °C 避光条件下稳定存放 6 个月。 

Master mix 解冻后可能出现些许白色沉淀，室温放置片刻并上下颠倒，沉淀即会溶解。请确认沉淀完全溶解，并充分混匀后使用。

质量控制

纯度检测：所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶、核酸残留。

功能检测：以质粒或 HeLa 细胞总 RNA 逆转录产物的稀释液为模板，扩增 5 个基因，扩增曲线批次内相近。

实验流程（以 ABI StepOnePlus™为测试机型）

1. 在 qPCR 管中配制如下混合液  

反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：

a.—般来说反应体系中引物终浓度为 0.2 mM 即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度范围内（0.1-1.0 μM）调整引物浓度。

b.qPCR 灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。

c.如模板类型为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。

2. 按下列条件进行 qPCR 反应

A:该预变性条件适合绝大多数扩增反应，如模板结构复杂，可将预变性时间延长至 3 min 提高预变性效果。

B:延伸时间请根据您使用的 Real-timePCR 仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整；使用 ABI 7700 和 7900HT 时至少 30sec；使用 ABI 7000 和 7300 时至少 31sec；使用 ABI 7500 时至少 34sec；使用 ABI StepOnePlus™时至少 10sec。

TanMan 探针设计指南

1. 探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域。

2. 探针长度一般为 18-40 bp。

3. 应避免连续相同碱基出现，特别是要避免 GGGG 或者更多连续的 G 出现。

4. 探针 5’端应避免使用碱基 G。 5. 探针的退火温度应为 65-67 ℃。

6. 如果序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。

常见问题与解决方案

1. 扩增曲线形状异常

①扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

②扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于 CT 值。减小基线终点（CT 值 4），重新分析数据。

③个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

2. 反应结束无扩增曲线出现

①反应循环数不够：一般设置循环数为 40, 但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。

②确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在 72℃延伸阶段。

③确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过 PAGE 电泳检测完整性，以排除其降解的可能。

④模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

⑤模板降解：重新制备模板，重复实验。

3. CT 值出现太晚

①扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。

②模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

③模板降解：重新制备模板，重复实验。

④PCR 产物太长：推荐 PCR 产物长度为 80 bp-150 bp。

⑤体系中存在 PCR 抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实 验。

4. 阴性对照出现明显扩增

①反应体系污染：更换新的 Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配置，减少 气溶胶污染。

②引物二聚体的出现：配合融解曲线进行分析。

5. 绝对定量时标准曲线线性关系不佳

①加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。

②标准品降解：重新制备标准品，重复实验。

③模板浓度太高：提高模板稀释倍数。

6. 融解曲线出现多峰 ①引物设计不佳：根据设计原则设计合成新的引物。

②引物浓度太高：适当降低引物浓度。

③cDNA 模板带有基因组污染：重新制备 cDNA 模板。

7. 实验重复性差

①加样体积失准：使用性能优异的移液器；将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。

②定量 PCR 仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。

③模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。

Note

For research use only. Not suitable for clinical or therapeutic use.